孫毅同志于1989年12月和1993年7月在美國(guó)堪薩斯州立大學(xué)遺傳系分別獲理學(xué)碩士、博士學(xué)位，1994年7月回國(guó)組建山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，現(xiàn)任該中心研究員、主任。該同志曾先后赴丹麥、英國(guó)、澳大利亞等國(guó)進(jìn)行學(xué)習(xí)和合作研究，其主要業(yè)績(jī)?nèi)缦拢?/P>

1. 主持和參與主持國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家“863”等國(guó)家與省級(jí)科研項(xiàng)目11項(xiàng)，已完成8項(xiàng)。主要研究方向?yàn)檗r(nóng)作物基因轉(zhuǎn)化及其方法和優(yōu)良性狀基因克隆及利用。已育出高抗真菌性病害的玉米、小麥、西瓜等優(yōu)良轉(zhuǎn)基因品系。合作構(gòu)建成新型生物殺蟲(chóng)劑—重組殺蟲(chóng)桿狀病毒，該病毒對(duì)棉鈴蟲(chóng)的毒殺作用比野生型病毒提高100倍。他參與主持構(gòu)建的雙價(jià)抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)化載體已經(jīng)導(dǎo)入棉花品系中，并表現(xiàn)出對(duì)棉鈴蟲(chóng)的良好抗性，為植物基因工程抗蟲(chóng)育種提供了新的優(yōu)良抗源。曾獲山西省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)兩項(xiàng)，農(nóng)業(yè)科技承包一等獎(jiǎng)兩項(xiàng)，創(chuàng)社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益5000余萬(wàn)元。

2. 發(fā)明了兩種新的植物轉(zhuǎn)基因方法，均已獲國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利——超聲波處理花粉介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)化方法（專(zhuān)利號(hào)：ZL 991211529，）和農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化方法（專(zhuān)利號(hào)：ZL 011041854），并分別獲香港國(guó)際新技術(shù)新產(chǎn)品博覽會(huì)和尤里卡世界發(fā)明博覽會(huì)金獎(jiǎng)各一項(xiàng)，日內(nèi)瓦國(guó)際專(zhuān)利技術(shù)成果博覽會(huì)金獎(jiǎng)兩項(xiàng)。這兩種方法公布后，已經(jīng)在國(guó)際上引起了較大的反響，使我國(guó)擁有了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的植物轉(zhuǎn)基因方法。

3. 在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物發(fā)表論文100余篇，包括美國(guó)的《Theoretical and Applied Genetics》、德國(guó)的《Plant Breeding》、英國(guó)的《Applied Biochemistry and Biotechnology》、日本的《Cytologia》、我國(guó)的《植物學(xué)報(bào)》、《作物學(xué)報(bào)》、《植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)》等。他發(fā)表的論文在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物和論著中被引用600余次（其中SCI引用180余次）。他還參與主編了《高粱學(xué)》（中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社）、《雜交高粱遺傳育種》（中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社）和《農(nóng)作物雜種優(yōu)勢(shì)》（中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社）三部專(zhuān)著，后者獲第十三屆中國(guó)圖書(shū)一等獎(jiǎng)。

4. 被聘為香港國(guó)際新技術(shù)投資開(kāi)發(fā)中心高級(jí)工程師，山西大學(xué)、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，已經(jīng)培養(yǎng)博士、碩士研究生20余名。1997年獲國(guó)家教委和人事部授予“優(yōu)秀留學(xué)回國(guó)人員”及國(guó)家外專(zhuān)局授予“全國(guó)引進(jìn)國(guó)外智力先進(jìn)工作者”稱(chēng)號(hào)，2001年被山西省人民政府授予“優(yōu)秀留學(xué)回國(guó)人員”和山西省科協(xié)授予“優(yōu)秀科技工作者”稱(chēng)號(hào)，2002年被山西省勞動(dòng)競(jìng)賽委員會(huì)授予“五一勞動(dòng)獎(jiǎng)?wù)隆辈�獲“山西十大科技富民專(zhuān)家”稱(chēng)號(hào)，2003年被山西省農(nóng)學(xué)會(huì)授予“優(yōu)秀科技工作者”稱(chēng)號(hào)。

植物轉(zhuǎn)基因新方法研究

山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心孫  毅

1、本研究方向國(guó)內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀

植物轉(zhuǎn)基因研究對(duì)于提高農(nóng)作物產(chǎn)量、抗病蟲(chóng)能力、抗逆性和改進(jìn)品質(zhì)等方面具有重要意義。自1983年第一例轉(zhuǎn)基因植物問(wèn)世以來(lái)，植物轉(zhuǎn)基因研究得到迅速發(fā)展，截止到2006年底，轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植面積已達(dá)1億余公頃。盡管轉(zhuǎn)基因植物不斷出現(xiàn)，但大面積應(yīng)用到商業(yè)化生產(chǎn)中的轉(zhuǎn)基因作物品種只有玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等少數(shù)幾種作物。對(duì)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究發(fā)展緩慢，缺乏能高效、實(shí)用和大規(guī)模轉(zhuǎn)化作物品種的轉(zhuǎn)基因方法是阻礙植物基因工程產(chǎn)生更大經(jīng)濟(jì)效益的主要原因之一。對(duì)絕大多數(shù)植物而言，轉(zhuǎn)基因技術(shù)還只停留在實(shí)驗(yàn)室階段。目前轉(zhuǎn)基因研究主要采用兩種經(jīng)典的轉(zhuǎn)基因方法：一是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；二是基因槍轟擊法。前者由于宿主范圍的限制，多用于雙子葉植物；后者由于要求的試驗(yàn)設(shè)備昂貴，主要用于單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。在眾多的植物種中，主要農(nóng)作物多屬于單子葉植物。單子葉植物基因轉(zhuǎn)化目前主要采用基因槍轟擊法，該法不僅試驗(yàn)設(shè)備昂貴，而且轉(zhuǎn)化效率低，表達(dá)效果較差。這些缺陷都大大限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用。因此，一些學(xué)者致力于尋求一種更加簡(jiǎn)便有效的轉(zhuǎn)基因方法。

2、  本研究創(chuàng)新點(diǎn)與科學(xué)論述

我們?cè)诰C合分析前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)多年摸索，創(chuàng)新了兩種植物轉(zhuǎn)基因新方法，并獲得了國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利。它們分別為，“結(jié)合超聲波處理的花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法”（中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利號(hào)：ZL99121152.9；《植物學(xué)報(bào)》43:275-279）和“農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物萌發(fā)種子基因方法種子轉(zhuǎn)基因方法”（中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利號(hào)：01104185.4；《Biotechnology & Applied Biochemistry》 46: 51-55）。這兩種方法大大簡(jiǎn)化了植物轉(zhuǎn)基因操作過(guò)程，并有可能提高轉(zhuǎn)化效率。此外，這兩種方法最大的創(chuàng)新之處在于可使植物基因工程育種手段從人們普遍認(rèn)為的實(shí)驗(yàn)室“高精尖”技術(shù)轉(zhuǎn)化為廣大常規(guī)育種工作者手中的有力武器，給植物育種工作帶來(lái)巨大的變革和新的活力。本研究的最終目標(biāo)是“使高新技術(shù)實(shí)用化，使貴族技術(shù)平民化”，為植物基因工程提供一種高效、簡(jiǎn)便、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的基因轉(zhuǎn)化新方法，使轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為常規(guī)育種家手中的有力武器。

1、結(jié)合超聲波處理的花粉介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)基因方法，以玉米、高粱、棉花、蘋(píng)果和油菜等作物為試材，在開(kāi)花期收集花粉，借助超聲波等物理方法處理，促使外源DNA進(jìn)入花粉粒，并通過(guò)授粉將外源DNA導(dǎo)入到受體植物中。目前已在玉米上獲得了轉(zhuǎn)基因植株，其轉(zhuǎn)化率可達(dá)40%以上，并初步證明該方法在棉花、高粱、油菜和蘋(píng)果等作物上也是可行的，說(shuō)明其對(duì)大多數(shù)單子葉和雙子葉植物都有普遍的應(yīng)用價(jià)值。

利用花粉作為載體介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化，既能避免傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法所要求的組織培養(yǎng)過(guò)程，以及長(zhǎng)期組培所帶來(lái)的再生困難，幼苗早期夭亡，后代育性不正常，易產(chǎn)生變異等一系列問(wèn)題，又能避免轉(zhuǎn)化體細(xì)胞所帶來(lái)的易形成嵌合體以及基因槍法的耗資大、轉(zhuǎn)化率低等問(wèn)題。本轉(zhuǎn)化方法將現(xiàn)代分子生物學(xué)手段與傳統(tǒng)育種手段相結(jié)合，具有高效、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn)，所用儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、易操作，應(yīng)用前景十分廣闊。該方法的廣泛應(yīng)用將會(huì)創(chuàng)造出巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。

2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物萌發(fā)種子轉(zhuǎn)基因方法，以植物萌發(fā)種子為受體，以攜帶外源基因片段的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒為基因供體，在種子萌發(fā)初期，人為地在其生長(zhǎng)點(diǎn)部位造成創(chuàng)傷，并將受傷種子在加有乙酰丁香酮或雙子葉植物浸提液的條件下與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，使其感染萌發(fā)胚的生長(zhǎng)點(diǎn)，并將載體上的外源基因片段轉(zhuǎn)移到受體基因組中。然后將發(fā)芽的種子正常播種，如外源基因載體上帶有選擇標(biāo)記基因，可在苗期進(jìn)行針對(duì)性篩選，并收獲轉(zhuǎn)化植株上的種子。對(duì)收獲的轉(zhuǎn)化株種子提取總DNA，做進(jìn)一步篩選鑒定(如采用PCR擴(kuò)增或Southern雜交等方法)。

本發(fā)明利用植物萌發(fā)種子作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，避免了傳統(tǒng)農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法所要求的嚴(yán)格的組織培養(yǎng)技術(shù)，它既具有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化率較高，導(dǎo)入基因整合率高和大多為單拷貝等優(yōu)點(diǎn)，又不需要植物組織培養(yǎng)條件，不需經(jīng)過(guò)冗長(zhǎng)繁瑣的組織培養(yǎng)過(guò)程。其轉(zhuǎn)化處理的直接產(chǎn)品是轉(zhuǎn)化植株或種子。利用種子作為受體，可使獲得轉(zhuǎn)化種子的周期大大縮短，而且種子取材方便，實(shí)驗(yàn)不受季節(jié)限制。因此，本發(fā)明為植物的基因轉(zhuǎn)化提供了一條簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、更易為常規(guī)育種與基因工程研究人員所采用的新途徑。

3、 本研究的科學(xué)價(jià)值、應(yīng)用前景和發(fā)展方向

本研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金 （30340033）的資助。我們發(fā)明的方法公布后，已經(jīng)在國(guó)際上引起了較大的反響。美國(guó)出版的《Agri Cell Report》均做了報(bào)道，并分別獲得香港國(guó)際新技術(shù)新產(chǎn)品博覽會(huì)金獎(jiǎng)、尤里卡國(guó)際專(zhuān)利成果博覽會(huì)金獎(jiǎng)各一項(xiàng)和日內(nèi)瓦國(guó)際專(zhuān)利技術(shù)成果博覽會(huì)金獎(jiǎng)兩項(xiàng)。

由于我們發(fā)明的技術(shù)操作簡(jiǎn)單、實(shí)用性強(qiáng)，所需儀器相對(duì)簡(jiǎn)單，獲取基因轉(zhuǎn)化植株或種子所需周期較短，最適合于將常規(guī)育種技術(shù)與植物基因工程技術(shù)相結(jié)合，可供一般育種家和種子公司，特別是第三世界的育種家和種子公司使用。采用這兩項(xiàng)技術(shù)可使育種者減少培育優(yōu)良新品種的費(fèi)用和人力，縮短培育基因工程新品種所需的時(shí)間，從而產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益。我們的發(fā)明是迄今由我國(guó)科技人員獲得專(zhuān)利的唯一植物基因轉(zhuǎn)化方法。它極有可能部分取代現(xiàn)在國(guó)際上通用的農(nóng)桿菌和基因槍轉(zhuǎn)化法�，F(xiàn)植物基因工程采用的主要方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法的專(zhuān)利均為國(guó)外公司擁有。我國(guó)科研人員采用這兩種方法獲得的轉(zhuǎn)基因品種如進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，很可能會(huì)面臨這些公索取得巨額專(zhuān)利使用費(fèi)的被動(dòng)局面。而我們的發(fā)明將有可能向國(guó)內(nèi)外生物技術(shù)和作物育種公司進(jìn)行轉(zhuǎn)讓?zhuān)瑥亩鵀閲?guó)家創(chuàng)造巨大效益。

山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心簡(jiǎn)介

山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心是全民所有制事業(yè)單位，隸屬于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 正式成立于1997年4月，現(xiàn)為山西省農(nóng)業(yè)基因工程重點(diǎn)學(xué)科點(diǎn)。本中心的主要任務(wù)和研究方向是利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，培育具有抗旱、抗病蟲(chóng)和抗逆性強(qiáng)的新品種，主要研究對(duì)象是大田作物和園藝作物，現(xiàn)有科研人員20名，包括3名博士，8名碩士和9名學(xué)士。有博士生導(dǎo)師1名，碩士生導(dǎo)師3名。中心下設(shè)4個(gè)研究室，即基因操作研究室、園藝作物生物技術(shù)研究室、真菌研究室和植物細(xì)胞及胚胎學(xué)研究室，另控股山西神力源生物技術(shù)有限公司，其主要產(chǎn)品為靈芝孢粉及其它真菌類(lèi)保健食品。

1996年以來(lái)，中心先后承擔(dān)國(guó)家863和國(guó)家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目8項(xiàng)，山西省科技攻關(guān)、省自然科學(xué)基金項(xiàng)目等省級(jí)項(xiàng)目23項(xiàng)，除在研項(xiàng)目外，都按期圓滿(mǎn)完成研究任務(wù)。

目前開(kāi)展和涉及的研究方向：植物分子標(biāo)記輔助育種研究、優(yōu)良基因的克隆、轉(zhuǎn)基因方法的研究、轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)育種中試體系的建立、植物基因工程的生物安全性研究、轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)研究。

本中心已找到數(shù)個(gè)與高粱不育性相關(guān)的SSR標(biāo)記，分離構(gòu)建了蝎毒-幾丁質(zhì)酶雙價(jià)抗蟲(chóng)基因，并同國(guó)內(nèi)外一些著名高等學(xué)府合作引進(jìn)了抗旱耐鹽的甜菜堿基因和脯氨酸脫氫酶基因，具有廣譜性殺蟲(chóng)作用的幾丁質(zhì)酶基因和絲氨酸酶抑制劑基因，可使果菜長(zhǎng)期保鮮的細(xì)胞激動(dòng)素基因和抗低溫冷害的基因，以及能夠縮短果樹(shù)童期、提早開(kāi)花的植物發(fā)育調(diào)控功能基因等。

迄今為止，本中心已獲山西省科技進(jìn)步應(yīng)用一等獎(jiǎng)一項(xiàng)、二等獎(jiǎng)4項(xiàng)，農(nóng)業(yè)技術(shù)承包一等獎(jiǎng)2項(xiàng)， “香港國(guó)際高新技術(shù)博覽會(huì)”和“尤里卡世界專(zhuān)利技術(shù)成果博覽會(huì)”金獎(jiǎng)各一項(xiàng)，“日內(nèi)瓦國(guó)際專(zhuān)利技術(shù)成果博覽會(huì)”金獎(jiǎng)2項(xiàng)，選育并通過(guò)審定西瓜新品種2個(gè)，獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利2項(xiàng)，并在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物和專(zhuān)著上發(fā)表論文100余篇。同時(shí)本中心與美國(guó)威斯康辛大學(xué)、堪薩斯州立大學(xué)，英國(guó)牛津大學(xué)，我國(guó)的北京大學(xué)、山西大學(xué)、山西農(nóng)大和省農(nóng)科院各研究所開(kāi)展廣泛合作，推動(dòng)了農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究在全省的廣泛開(kāi)展，并已經(jīng)培養(yǎng)博士、碩士研究生20余名，現(xiàn)仍有10余名研究生在讀。